El nitrógeno  es uno de los nutrientes esenciales para el adecuado crecimiento y productividad de las plantas. A pesar de ser un elemento muy abundante en la naturaleza, pues la atmósfera contiene un 78% de N, es normalmente un nutriente deficiente en el suelo para sistemas intensivos de producción. El N en la atmósfera se encuentra en forma no disponible para las plantas, esto es en forma de nitrógeno molecular, el cual está compuesto por dos átomos (N₂), unidos por un triple enlace. Para ser utilizado por plantas, el N₂ debe ser convertido en formas asimilables, y este proceso se realiza por medio de los organismos presentes en la rizósfera de las plantas o en la superficie del suelo.

El proceso se conoce como fijación biológica del N₂ atmosférico, el cual es convertido en formas asimilables para las plantas utilizando un complejo enzimático denominado nitrogenasa, presente en algunas bacterias rizosféricas y algas verde azules (cianobacterias).

Desde el año 1886 se conocen microorganismos que, en asociación simbiótica con las plantas, son capaces de generar nódulos en las raíces de leguminosas y realizar el proceso de fijación biológica de N. Sin embargo, posteriores estudios de comienzos del siglo XX llevaron a descubrir otros microorganismos capaces de realizar el proceso asociados a otras especies vegetales o en forma libre y bajo diferentes mecanismos, que hoy día se comercializan en la agricultura chilena, con especial interés en la diversidad de funciones benéficas que pueden cumplir en suelo y cultivos.

La fijación de N

El proceso es llevado a cabo por bacterias diazotróficas, un grupo de alta diversidad distribuido filogenéticamente entre Bacteria y Archae. Dentro de las bacterias fijadoras de N₂, se diferencian cuatro grandes grupos de acuerdo a la forma en la que se realiza el proceso de fijación: el proceso puede ser llevado a cabo en condiciones simbióticas o no simbióticas y a su vez, dentro de este último, los microorganismos pueden estar libres en la rizósfera circundante (fijación no simbiótica, libre), asociados a la raíz de la planta (fijación no simbiótica de tipo asociativo) y dentro deltejido vegetal, (fijación no simbiótica por endófitos), siendo la fijación simbiótica en leguminosas el proceso que más aporta (cerca del 80%) a la fijación biológica de nitrógeno (FBN). Al grupo de las bacterias fijadoras simbióticas pertenecen los miembros de la familia Rhizobiaceae, los cuales hacen simbiosis con leguminosas (ejemplo Rhizobium sp.) y árboles no leguminosos (actinomycete, Frankiasp.) El segundo grupo corresponde a las bacterias asociativas, que aunque no presentan nódulos, exhiben mecanismos de señalización química con ciertos grupos de plantas y se ubican en la superficie de las raíces desde donde realizan el proceso de fijación. A este grupo pertenecen las bacterias del género Azospirullum.

El tercer grupo corresponde a los microorganismos de vida libre tipo Azotobacter, Pseudomonas, Burkholderiaspp., Enterobacter cloacae,Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae  y Pantoea  sp., cianobacterias o algas verde azules – Anabaena, Nostoc que pueden fijar cantidades importantes de N entre 0 to 60 kg N ha⁻¹ año⁻¹, siendo particularmente importante en suelos bajo manejo orgánico, pero también bajo un sistema de producción convencional, dentro de un Manejo Integrado de la Nutrición (MIN).

Finalmente, en relación a los endófitos, Gluconoacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sp. y Azocarussp. son géneros bacterianos reconocidos en cultivos de caña de azúcar, pastos y maíz, entre otros cultivos.

Genes y sistemas de fijación

La simbiosis involucra diferentes genes y complejas vías moleculares y bioquímicas que terminan en la formación de nódulos y la colonización de bacterias tipo Rhizobiumcomo simbiontes intracelulares. El complejo enzimático involucrado es la nitrogenasa compuesto por dos componentes: dinitrogenasa reductasa (proteína férrica), encargada de proveer energía con alto poder reductor y la dinitrogenasa (cofactor metálico), que emplea los electrones para reducir N₂a NH₃.

Se han identificado tres sistemas de fijación diferentes con base en el cofactor metálico: (a) Mo- nitrogenasa, (b) V-nitrogenasa y (c) dinitrogenasa reductasa Fe-nitrogenasa, siendo el molibdeno y el hierro cofactores fundamentales para la operación de todos los sistemas biológicos de fijación de N₂.

Los genes que regulan la fijación son los genes nif, encontrados en los organismos tanto simbióticos como no simbióticos, e incluye genes estructurales, de activación, biosíntesis y regulación de las proteínas y cofactores. El proceso de fijación de N₂es extremadamente sensible a las concentraciones de oxígeno y depende enormemente de la energía, pues es un proceso de alto costo para el microorganismo, ya que se requiere de estrategias diversas como la formación de nódulos (Rhizobium, Frankiaactinorizas), donde el oxígeno es capturado por la leghemoglobina (de manera similar a como ocurre con la hemoglobina) o el incremento de la tasa respiratoria (Azotobactersp.).

Para que ocurra la reacción química se requieren 16 mol de ATP por cada mol de N₂ reducido a NH₃, dada la ecuación:

N₂+ 8H⁺ + 8e^– + 16ATP ↔ 2NH₃ + H₂ + 16ADP

Esto indica también que el proceso depende de la disponibilidad de C y P en el suelo, por lo que las aplicaciones de los biofertilizantes a base de fijadores de N deben asegurar la presencia de materia orgánica de rápida asimilación y fuentes de P que pueden ser orgánicas o minerales.

El amonio resultante da origen a aminoácidos y otros compuestos orgánicos como ácido alantoico o ureidos, todas fuentes de N para las plantas

Biofertilizantes multifunción y bioestimulantes

La zona de influencia de la raíz de las plantas, esa zona de suelo que rodea el sistema radicular, se conoce como la rizósfera. A las bacterias que colonizan ese ambiente se las denomina rizobacterias, y se establecen en ese lugar porque además de agua, oxígeno y un soporte mecánico, las raíces sintetizan, acumulan y secretan diversos compuestos que resultan muy atractivos para un gran número de comunidades microbianas diversas, heterogéneas y metabólicamente activas.

Los microorganismos promotores de crecimiento son bacterias, principalmente, y hongos de suelo que viven alrededor o sobre las raíces de las plantas y que están directa o indirectamente involucradas en la promoción del crecimiento y desarrollo a través de la producción de reguladores químicos en el ambiente rizosférico.

Estos mecanismos de promoción pueden estar relacionados directamente con el crecimiento a través de la movilización o solubilización de nutrientes (nitrógeno, fosforo o minerales esenciales) o a través de la modulación de niveles de hormonas, o indirectamente por disminución de los efectos inhibitorios de patógenos sobre el crecimiento vegetal, es decir, como controladores biológicos.

Tal es el caso de bacterias fijadoras de N simbióticas (como algunas especies de Rhizobium) pero en especial las de fijación libre de N, como Azotobacter sp., asociativas como Azospirillum sp. y endófitas como Herbaspirillum sp. o Gluconoacetobacter sp., que son reconocidas por su participación en la solubilización de fosforo inorgánico en el suelo.

Igualmente aprovechando este mecanismo de solubilización por producción de ácidos a partir de fracciones lábiles de C, pueden ejercer otros efectos como la solubilización de K y elementos esenciales como el Zn, además de promover el crecimiento vegetal por producción de diferentes compuestos como vitaminas o aminoácidos, de carácter bioestimulador.

Azotobacter sp., es una bacteria diazotrófica de vida libre, con siete especies conocidas: A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armeniacus, A. salinestri y A. paspali. Es una de las bacterias más versátiles en agricultura, pues además de fijar N2 sin tener preferencia por huésped, ni formar nódulos, participa en la reducción de nitratos, solubiliza P y K, moviliza Ca (elemento que requiere en importantes concentraciones), sintetiza auxinas, citoquininas y sustancias similares a ácido giberélico que ejercen un efecto de regulación del crecimiento vegetal. Estas sustancias hormonales originadas en la rizósfera donde se encuentra la bacteria, o en la superficie de la raíz, afectan el crecimiento de las plantas donde habitan.

A pesar de ser consideradas diazótrofas de vida libre, presentan mayor eficacia como bioestimulantes en asociación con algunos fenotipos de plantas, sin necesidad de realizar el proceso de fijación de N₂. Por ejemplo, Azotobacter chorcoccum ha sido ampliamente estudiada en Cuba, Colombia, México; es una bacteria que puede hacer asociación endofítica con plantas de maíz incrementando el rendimiento de 2 al 45% en hortalizas, del 9 al 24% en caña de azúcar, de 0 al 30% en maíz, sorgo, raps, etc. Diversas investigaciones realizadas en la última década han definido cantidades de N₂fijado de 50-80 kg N ha-1 para Rhizobiumsp., 40 kg N ha^-1 para Azotobactery Azospirillium, 60-120 kg N ha^-1 para algas verde azules (BGA) y 40 kg N ha^-1 de Azolla, con incrementos no sólo en rendimiento sino también en biomasa aérea y radicular.

Limitantes de la fijación

Por ser la fijación un proceso que involucra una reacción enzimática, la eficacia y actividad de la cepa del microorganismo, así como la concentración de C lábil y N en la solución de suelo se convierten en las principales limitantes. Por ello, en condiciones de exceso de N soluble, a pesar de contar con productos biofertilizantes de buena concentración (> 1x 107 UFC/ ml o g), puede que el mecanismo de la nitrogenasa se bloquee o sea poco eficiente y la bacteria no realice la función particular de fijación. El inoculante podría mantener sus demás funciones (solubilización de fósforo o bioestimulación), que podrían terminar en el incremento de N en tejido, pero no se lleva a cabo la fijación biológica de N₂.

Las aplicaciones directas, peletización o uso de semilla peletizada con la cepa correcta de bacterias rhizobiales, actinorrizas o cianobacterias, favorece notablemente, en el caso de las leguminosas, el éxito de la inoculación y de la fijación simbiótica. En el caso de biofertilizantes a base de bacterias fijadoras libres, asociativas o endófitas, las aplicaciones pueden ser en drench, o a suelo, pero incluso los productos pueden ser empleados en aplicaciones foliares, como bioestimulantes ya sea por producción de sustancias promotoras, sideróforos o inductores de resistencia sistémica.

Indicadores de la fijación de N en campo

Medir la fijación de nitrógeno en campo no es una tarea simple. Sin embargo, existen indicadores bioquímicos y agronómicos que un productor puede tener en cuenta para evaluar los efectos de las aplicaciones de microorganismos fijadores de N.

Indicadores agronómicos

En campos nuevos, el verdor, o concentración de clorofila o vigor (NDVI) pueden ser utilizados como indicadores de eficiencia. Si se trata de leguminosas, la observación directa de nódulos evidentes, abundantes, carnosos y rosados, después de 2-3 semanas de germinación, es indicador de actividad y buena modulación. Igualmente, mediante un análisis de N en tejido o materia seca es posible determinar la eficiencia de la fijación

Indicadores bioquímicos

Indicadores más sensibles reducción de acetileno como medida indirecta de la actividad nitrogenasa, empleado para la selección de cepas promisorias para evaluar los efectos de productos biológicos en base a microorganismos fijadores de N.

La fijación biológica de N₂ es realizada por muchos microorganismos en el suelo y no solo está relacionada a las especies leguminosas. Junto a la fijación de N₂, los microorganismos tienen funciones adicionales como la producción de sustancias bioestimulantes y la solubilización de otros nutrientes, sin embargo, para que funcionen apropiadamente en el suelo, deben existir las condiciones apropiadas para ello, entre otras, pH adecuado, disponibilidad de C soluble y bajos niveles de N en el suelo.

Escrita por: María Martínez, Investigadora de la Universidad Técnica Federico Santa María

Rene Novo Sordo, Profesor de mérito y titular de microbiología de suelos de la Universidad de la Habana, Cuba.